Pfu酶用途
主要用于对 PCR 保真性要求较高的实验，如基因筛选、克隆表达、突变检测、定点突变等等。
Pfu酶特征
• 克隆有 Pyrococcus Furiosis DNA Polymerase 基因的大肠杆菌经诱导表达后，再经三次过柱纯化分离出来的一个约 90 KD 的重组蛋白。
• 具有 5' 到 3 ‘合成 DNA 的能力；有 3 '到 5 ‘外切酶的活性即纠错能力，通俗地说，出错的机率是普通 Taq 酶的十分之一。为了减少由 3′-5′ 外切酶活性引起的引物降解，闪晶公司强烈推荐在冰浴上添加所有的试剂并且在温度达到 60 -65°C 时再加入 Pfu DNA 聚合酶以便进行热启动或者在冰浴上添加试剂后放在预热到 95°C 的 PCR 仪上。
• 无 5 ' 到 3 ‘外切酶的活性， 不能用于实时荧光PCR 。
• 无 3 ‘端加 A 的功能，产物为平端，如果需要做 T － A 克隆，需要做添 A 实验。
• 无外源核酸酶和细菌 DNA 污染。
• SDS － PAGE 检测，纯度＞ 95% 。
• 延伸温度 72 ℃ ， Mg 2+ 浓度 2.0mM ， dNTPS 浓度 0.2mM ，延伸速度为 600base/min ； Pfu DNA 聚合酶比 Taq DNA 聚合酶的延伸反应速率低，因此闪晶公司推荐延伸反应时间为每 kb 需 2 分钟。
• 10 × PCR buffer: 500mM KCl, 100mM Tris-HCl (pH 9.0 ， 25℃ ), 1% TritonX-100 和 20mM MgSO4 。
• Storage buffer: 20mM Tris-HCl (pH 8.0), 100mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 50% 甘 油， 0.5% Nonidet -P40 和 0.5% Tween20 。
Pfu酶单位定义
在 74℃ 条件下， 30 分钟内催化 10nmol dNTP 的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量为一个单位。反应条件为： 50mM Tris-HCl (pH 9.0 ， 25℃ ), 50mM NaCl, 5mM MgCl2, 200mM dNTP( 含未标记和标记 [3H] dTTP ), 10mg 活化的小牛胸腺 DNA 和 0.1mg/ml BSA, 终反应体积为 50ml 。
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