无菌室的消毒灭菌工作，对于那些不能利用物理方法进行灭菌的物品、空气、工作面、操作者皮肤、某些实验器皿等。常用的化学消毒剂包括甲醛、高锰酸钾、70%～75%乙醇、过氧乙酸、来苏尔水、0.1%新洁尔灭、环氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%～75%乙醇、0.1%～0.2%氯化汞、10%次氯酸钠、饱和漂白粉等进行实验材料的灭菌。
利用甲醛加高锰酸钾[(2mL甲醛+1g高锰酸钾)/m3]或乙二醇(6mL/m3)等加热熏蒸法进行无菌室和培养室的消毒。在使用时应注意安全，特别是用在皮肤或实验材料上的消毒剂，须选用合适的药剂种类、浓度和处理时间，才能达到安全和灭菌的目的。
无菌操作室的消毒是至关重要的。由于无菌操作室的污染来源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸消毒，熏蒸是用高锰酸钾+甲醛[(2mL甲醛+1g高锰酸钾)/m3]进行无菌室的消毒。经常使用的无菌操作室，在每次使用前都应进行地面卫生清洁，并用紫外线灯照射30min，进行空气消毒。对超净工作台，每次操作前用紫外灯照射30min，然后用70%～75%酒精擦拭。
采自动物机体的实验材料，携带着微生物及杂质，接种前须进行表面消毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘汰。从动物机体采集的某些组织块，须用消毒剂进行浸泡处理，进行表面消毒。常用消毒剂有过氧化氢(10~12%，浸泡5~15 min)、过氧乙酸(0.05%，浸泡30s~1min)、酒精(70~75%，浸泡2 min)。
灭菌程序验证内容
撰写验证方案及制定评估标准。
确认灭菌设备技术资料齐全、安装正确，并能处于正常运行。
确认关键设备控制仪表在规定的参数范围内能正常运行。
采用被灭菌物品或模拟物品进行重复实验确认灭菌效果符合规定。
完善文件记录，撰写验证报告。
灭菌保证
灭菌效果与灭菌前产品污染程度及污染菌特性有关，把握微生物污染水平及污染菌耐受性，注意各个环节降低污染程度。
灭菌冷却阶段防止已灭菌物品再次污染。
适用生物指示剂、化学指示剂等监控灭菌结果。
生物指示剂
基本要求：
菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能污染菌的耐受性。
菌种应无致病性。
菌株应稳定，存活期长，易于保存。
易于培养。若使用休眠孢子，孢子含量在90%以上。
常用生物指示剂
湿热灭菌：嗜热脂肪芽孢杆菌孢子（ATCC7953等，活孢子数为5×105～5×106个/片)。
干热灭菌：枯草芽孢杆菌孢子（ATCC9372等，活孢子数为5×105～5×106个/片)。
辐射灭菌：短小芽孢杆菌孢子（ATCC27142等，活孢子数为5×107～5×108个/片)。
枯草芽孢杆菌孢子（ATCC9372等，活孢子数为5×105～5×106个/片)。
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