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北京亚华顺达科技有限公司
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| Roche — 潮霉素B |
作用机制：
潮霉素B是由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死细菌、真菌和高等真核细胞。潮霉素B通过干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读而抑制蛋白合成。目前常用于筛选和维持培养含潮霉素抗性基因的原核或真核细胞。
抗性基因：
对潮霉素B的抗性源自编码潮霉素B磷酸转移酶（Hph）的基因。至今发现两种来源：
► Streptomyces hygroscopicus产生的Hph抗性基因；
► Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae内质粒携带的Hph抗性基因（常用）；
生物应用：
1） 筛选和维持培养稳定转染Hph+载体的原核细胞或真核细胞（植物细胞和哺乳动物细胞）；
2） 由于作用模式的差异，常与G418 (GeneticinTM)，Zeocin™ 和blasticidin S联合使用，筛选稳定转染两个不同载体的细胞株；
双抗性稳定转染细胞筛选的抗生素作用机制及抗性
抗生素
抗性机制
抗性基因
哺乳动物筛选浓度
潮霉素B
干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读
Hph
200~500μg/mL
G418
干扰80S核糖体功能和抑制蛋白合成
Tn5/Tn601
100~1000μg/mL
Zeocin
掺入或者切割DNA引起细胞死亡
Sh ble
50~100μg/mL
blasticidin S
核糖体上抑制肽键形成
Bsd/BSD
3~50μg/mL
3）抗病毒剂，由于潮霉素B选择性渗透进入因病毒感染增强通透性的细胞，而且具有抑制翻译的功效；
4）作为驱虫药加入动物饲料；
应用浓度：
潮霉素B用来筛选稳转株的工作浓度需要根据细胞类型，培养基，生长条件和细胞代谢率而变化。推荐使用浓度为50-1000 μg/mL，*佳浓度需要杀灭曲线来确定。
哺乳动物细胞·200-500 μg/mL；细菌/植物细胞·100-300 μg/mL；真菌·300-1000 μg/mL；
产品使用：
使用一：杀灭曲线确定*佳杀死浓度（仅作参考，因个人检测体系而异）
（1）往组织培养级的96孔板内加入未转染细胞，细胞密度约50-200细胞/孔；细胞贴壁之后，往每孔加入含不同浓度（如50-1000μg/mL，至少5个浓度）潮霉素B的200μL新鲜培养基；
（2）37℃，5% CO2培养箱孵育细胞10-14天；
（3）培养5-7天后更换新的培养液，培养液内含有相应浓度的潮霉素B；
（4）10-14天后使用细胞增殖方法如MTT，CCK-8等评估细胞活力；也可以通过检测细胞克隆数或百分比汇合率来确定毒性效应。一般选择在10-14天能够杀死所有细胞的*小浓度为*佳筛选浓度。
使用二：筛选稳定转染细胞
（1） 对于贴壁细胞，直接吸去60mm培养皿内的转染细胞培养基，然后加入含有潮霉素B的新鲜培养基5-6ml；对于悬浮细胞，无菌条件250x g,离心10min除去旧的转染细胞培养基，然后悬浮在约5ml的含潮霉素B的新鲜培养基；
（2） 5-7天后，如上方法更换含有潮霉素B的新鲜培养基；
（3） 再孵育细胞5-7天；
（4） 10-14天孵育后，培养体系中只含有能够表达潮霉素B抗性表型的活细胞。因此筛选之后如步骤一，更换不含潮霉素B的新鲜培养基。 |
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