DNA 测序技术主要依据 Sanger 的双脱氧链终止法。以 DNA 单链为模板，在特定条件下，用特异的引物在测序级 DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则，不断将 4 种脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 加到引物的 3'- 羟基末端并使引物链得到延伸。这种链的延伸是通过引物的 3'- 羟基和脱氧核糖核苷酸底物的 5'- 磷酸基团形成磷酸二酯键来完成的。如果这种反应体系中加入双脱氧核糖核苷酸 (ddNTP) ，这种 2'3'ddNTP 的 5'- 磷酸基团是正常的 (4 种不同的荧光标记 ) ，而 3' 位置缺少羟基，因此在 DNA 聚合酶作用下，仍然可以通过 5'- 磷酸基团与引物链的 3'- 羟基反应掺入到引物链中，但是由于 ddNTP 没有 3'- 羟基，不能继续与下一个 5'- 磷酸基团形成磷酸二酯键而导致引物链延伸的终止。这样，在测序反应体系中， DNA 引物链不断合成与偶然终止，产生一系列的长短不等的核苷酸链，然后将这些反应产物进行电泳，即可得测序图谱。
样品要求
样品类型
相应要求
菌体
1. 说明载体抗性类型，我们提供 Amp, Kan, Tet 及 Chl 四种抗生素。
2. 提供 1ml 左右过夜培养的菌液，加 15% 灭菌甘油，于 Eppendorf 管中封口保存，防止交叉污染或渗漏。
3. 大量样品测序，建议在一次性塑料培养皿固体培养基上穿刺培养。
4. 建议尽量提供穿刺培养的菌种。
质粒
1. 质粒溶于适量体积双蒸水中（不含 TE ），电泳检测总量大于 2mg 。
2. 建议用相关试剂盒纯化。
3. 如有可能，同时提供 1ml 含有相应质粒的菌液备用。
4. 大质粒必需注明载体长度。
未纯化 PCR 产物
1. 片段大于 150bp 。
2. 提供 50ul ～ 100ul PCR 扩增产物 ( 总量 500ng-1ug) 。
3. 取 3ul 样品，电泳检测应为明亮的一条带，无杂带。
纯化 PCR 产物
1.PCR 产物溶于双蒸水中（不含 TE ）。
2. 浓度大于 20ng/ul ，体积大于 20ul ，长片段需适当增加量。
3. 电泳检测条带专一。
自备的引物
1. 浓度不低于 5pmole/ul( 或 5umol/L) ，体积大于 20ul 。
2. 随机引物和简并引物不能用于测序。
3. 尽可能提供引物全序列、 PCR 退火温度，以供参考。
详情请登入 http://www.shinegene.org.cn 或来电 021-54460832 |
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