一、实验器材及试剂
1、实验器材
名称 厂家 型号
电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司 PL-203
超声细胞粉碎机 宁波新芝生物 JY92-IIn
台式高速冷冻离心机 Heal Force Neofuge 15R
纯水仪 青岛富勒姆科技 FBZ2001-UP-P
涡旋混合器 国产 MX-F
超低温冰箱 海尔 DW-86L626
水浴锅 姜堰市天力医疗器械厂有限公司 TL-420D
全自动研磨仪 国产 KH-III
自动洗板机 Rayto RT3100
酶标检测仪 BioTeK Epoch
2、主要实验耗材
耗材 厂家 货号
1000ul移液器 大龙 KE0037273
200ul移液器 大龙 YE3K030591
50ul移液器 大龙 DS35110
10ul移液器 大龙 KE0012951
300ul多道移液器 大龙 KA006318
二、ELISA实验步骤
按试剂盒说明书进行操作，不同指标操作不一样。具体以订购的试剂盒说明书为准。基本步骤如下：
1.包被：用碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10μg／ml。在聚苯乙烯酶标板的每孔加100μl，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。（一般商品化的试剂盒中已包被好抗体，此步骤可省略）
2.封闭：每孔加入200ul封闭液，37℃孵育1-2 h。
3.洗涤：小心揭掉封板膜，放入洗板机，洗涤3-5遍。也可以手动洗板：弃去液体，每孔加入300ul洗液，浸泡1-2min，在吸水纸上拍干，重复3-5遍。（一般商品化的试剂盒中已包被好抗体，前三个步骤可省略）
4.加样：加适当稀释的待检样品100μl于上述已包被的反应孔中。(同时做空白孔，倍比稀释的标准品孔，有条件可加做阴性对照孔及阳性对照孔作为质控点)。
5.温育：用封板膜封板后置37℃孵育1-2 h。
6.洗涤：同步骤3。
7.加抗体：于各孔中加稀释好的生物素化抗体工作液100 μl。
8.温育：用封板膜封板后置37℃孵育1 h。
9.洗涤：同步骤3。
10.加酶结合物：于各孔中加稀释好的酶结合物工作液100 μl。
11.温育：用封板膜封板后置37℃避光孵育30 min。
12.洗涤：同步骤3。
13.加显色底物：于各孔中加入TMB底物溶液100 μl，37℃避光反应10～30min，直到倍比稀释的标准品孔出现明显的颜色梯度为止。
14.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸100 μl，颜色由蓝色变为黄色。
15.结果测定：10min内，在酶标仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。 |
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