一、实验器材及试剂
1、实验器材
名称 厂家 型号
切片机 Leica Leica UC7
钻石切片刀 Daitome Ultra 45°
透射电子显微镜 hitachi HT7700
2、主要实验试剂
试剂 厂家 货号
电镜固定液 武汉谷歌生物 G1102
无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司
丙酮 国药集团化学试剂有限公司
812包埋剂 SPI 90529-77-4
二、透射电镜制片步骤
1、取材固定:新鲜组织确定取材部位,尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤,组织体积一般不超过1mm×1mm×1mm ,迅速投入电镜固定液4℃固定2-4h。细胞离心至管底可以看到绿豆大小的细胞团块,弃去培养液加入电镜固定液4℃固定2-4h。0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)漂洗3次,每次15min。
2、后固定:1%的锇酸·0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)室温(20℃)固定2h。0.1M磷酸缓冲液PB(PH7.4)漂洗3次,每次15min。
3、脱水:组织依次入50%-70%-80%-90%-95%-100%-100%酒精-100%丙酮-100%丙酮上行脱水,每次15min。
4、渗透:丙酮︰812包埋剂=1︰1 2-4h, 丙酮︰812包埋剂=2︰1渗透过夜,纯812包埋剂5-8h,将纯812包埋剂倒入包埋板,将样品插入包埋板后37度过夜。
5、包埋:60℃聚合48h。
6、切片:切片机切片60—80nm超薄切片。
7、染色:铀铅双染色(2%醋酸铀饱和水溶液,枸橼酸铅,各染色15min),切片室温干燥过夜。
8、透射电子显微镜下观察,采集图像分析。
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